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Infertilità Maschile
Microdelezioni del Cromosoma Y
Diagnosi molecolare dell'infertilità maschile mediante amplificazione genica (PCR) fluorescente di 24 loci STS della regione AZF del cromosoma Y + SRY
 
Problemi di infertilità riguardano circa il 15% delle coppie in età riproduttiva e, nel 50% circa dei casi, è a carico del partner maschile.
Negli ultimi anni è stato dimostrato che il 5-10% dei casi di oligo/azoospermia è imputabile a problemi genetici.
L’analisi genetica ha portato all’identificazione di microdelezioni di geni localizzati nei loci non polimorfici del gene AZF (Azoospermia Factor a,b,c), presenti in numero variabile e denominati STS (Sequenze Tagget Sites).
Attualmente, con lo sviluppo delle tecniche di biologia molecolare, è possibile dimostrare la presenza, in pazienti oligo-azospermici, di microdelezioni del cromosoma Y, così piccole da non poter essere rilevate da un esame classico del cariotipo. Ciò riveste una particolare importanza soprattutto in quelle coppie che si affacciano alla procreazione assistita, per conoscere con più precisione la possibilità di trasmettere ad un figlio lo stesso problema di sterilità del padre.

Il test per la ricerca delle Microdelezioni del Cromosoma Y consente di valutare se eventi di delezione hanno eliminato sequenze normalmente presenti sul cromosoma Y e coinvolte nella regolazione della spermatogenesi nell'uomo.
Il test consiste nell’amplificazione multipla mediante PCR fluorescente di 24 regioni monomorfiche del cromosoma Y STS, distribuite lungo i i loci AZFa, AZFb, ed AZFc del cromosoma Y (vedi foto in basso), ed è in grado di identificare quei soggetti in cui è presente una microdelezione di uno o più geni implicati nella spermatogenesi e quindi responsabile della infertilità maschile. Il test prevede, inoltre, l'esame di ulteriori due regioni STS, che fungono da controllo interno del sistema: la regione SRY (mediante la quale è possibile diagnosticare i maschi con cariotipo XX) e la regione ZFX/ZFY, comune a entrambi i cromosomi sessuali, impiegata come controllo della qualità del DNA.
Tranne rare eccezioni, le microdelezioni del cromosoma Y non sono state riportate nella popolazione fertile di controllo.
Il Test delle microdelezioni del cromosoma Y è oggi inserito,insieme all'indagine citogenetica, alla ricerca delle mutazioni del gene CFTR e, più recentemente insieme al polimorfismo 5T dell’introne 8 del gene CFTR, ed all’espansione della tripletta nucleotidica del recettore androgenico (AR), nell'iter diagnostico per la ricerca delle cause genetiche dell'infertilità maschile come anche all'interno del protocollo di preparazione alla fecondazione assistita, in quanto l’alterazione genetica potrebbe essere trasmessa alla prole maschile, nel caso in cui si proceda ad una fecondazione di tipo omologo.

DESCRIZIONE TECNICA DELL'ANALISI

Il protocollo di analisi prevede l’utilizzo di 4 differenti multiplex PCR fluorescente; ciascuna multiplex consente l’amplificazione di 6 regioni STS più 2 controlli interni: uno specifico per la regione SRY del cromosoma Y (mediante il quale è possibile diagnosticare i maschi con cariotipo XX ) ed uno comune ad entrambi i cromosomi sessuali (ZFX/ZFY).
Al termine dell’amplificazione, 0,5 µl di ciascun prodotti di PCR vengono uniti in pooling a 0,5 µl di size standard GS500 ROX (Applied Biosystems) e 0,5 µl di formamide deionizzata e sottoposti ad elettroforesi capillare in sequenziatore automatico ABI PRISM 310 (Applied Biosystems).
I risultati ottenuti da ciascuna corsa elettroforetica vengono successivamente analizzati con l’ausilio di un template realizzato con il software Genotyper® (Applied Biosystems), mediante il quale è possibile effettuare automaticamente la genotipizzazione delle regioni STS investigate (vedi figura in basso), e la valutazione della presenza di eventuali delezioni.
L’assenza di uno o più picchi, dovuta alla mancata amplificazione della corrispondente regione STS, permette di diagnosticare una microdelezione, che viene evidenziata in una tabella riepilogativa utilizzabile come report. Il protocollo prevede che ogni delezione debba essere confermata mediante l’amplificazione della regione corrispondente dapprima in duplex (assieme ad una regione contigua precedentemente positiva all’amplificazione) e successivamente in singleplex (come suggerito nelle linee guida europee).
Il kit impiegato per la ricerca delle microdelezioni del cromosoma Y è stato realizzato dalla Sezione di Ricerca e Sviluppo del laboratorio GENOMA, seguendo le linee guida dell'European Molecular Quality Network (EMQN).