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Infettivologia Molecolare
HPV - Papilloma virus - Analisi qualitativa
Diagnosi molecolare delle infezioni da HPV mediante amplificazione genica (PCR)
 

Il cancro della cervice è, come diffusione, la seconda forma di neoplasia nella donna. Molti studi epidemiologici hanno messo ormai in evidenza come l’ infezione da HPV sia il più importante fattore etiologico nello sviluppo di questo carcinoma . In particolare tre tipi di Papillomavirus, HPV 16, 18 e 31, sembrano essere correlati con lo sviluppo del carcinoma della cervice. 

L’amplificazione diretta da campione mediante gli strumenti di biologia molecolare è ancora una volta il metodo più veloce ed efficace per una diagnosi corretta che consenta di eseguire poi i necessari e periodici accertamenti diagnostici sui soggetti a rischio. E’ oggi infatti possibile identificare in tempi brevi da un campione che può essere sia una biopsia che un semplice pap-test, non solo la presenza del virus ma la sua appartenenza ai vari tipi (es. Papilloma 6 , 11 , 16 , 18 , 31 , 33 , 34 , 35 , 39 , 40 , 42 , 43 , 44 , 45 , 51 , 52 , 54 , 56 , 58, o altri tipi meno frequenti). L'attribuzione del tipo virale viene condotta mediante l'analisi di sequenza impiegando un sequenziatore automatico a tecnologia fluorescente e successiva comparazione della sequenza ottenuta con i tipi e sottotipi virali identificati e descritti in letteratura.

La DIAGNOSTICA MOLECOLARE nelle Lesioni da HPV dell'uomo 

L'infezione genitale da HPV è molto frequente negli uomini sessualmente attivi e si manifesta in forme polimorfe che vanno dal classico condiloma acuminato alle forme subcliniche papulomatose e maculari. L'importanza della diagnosi e del trattamento delle lesioni da HPV nell'uomo è confermata dall'evidenza che il rischio più significativo per la neoplasia cervicale è la presenza della condilomatosi genitale nel partner maschile. L'infezione genitale da HPV, anche nell'uomo è spesso asintomatica, senza lesioni clinicamente evidenti ma evidenziabili solamente con la peniscopia e, con una maggiore efficienza diagnostica, con indagini di Biologia Molecolare per la ricerca del DNA virale dell'HPV. Anche in questi casi l'uomo rappresenta ugualmente una importante riserva del virus, che gioca un ruolo significativo nella trasmissione e nella persistenza della malattia neoplastica nella donna in rapporto anche alla sua età ed al genotipo del virus infettante. Peniscopia e PCR nella diagnosi dell'infezione da HPV: due tecniche a confronto La tecnica per il depistage delle lesioni genitali maschili da HPV è chiamata peniscopia; anche nelle forme ben evidenti all'osservazione clinica, la peniscopia permette una definizione dettagliata della lesione esofitica e costituisce una guida per una terapia efficace e mirata, permettendo di evidenziare quelle lesioni associate che possono sfuggire completamente all'esame clinico, senza l'ausilio della visione ingrandita del peniscopio. Le lesioni condilomatose possono presentarsi sotto forma di: · - lesioni esofitiche, multicentriche, multifocali e polimorfe, localizzate a livello cutaneo, mucoso, uretrale distale e tutte con una buona correlazione istologica; · - papule, spesso di osservazione difficoltosa anche alla colposcopia, rilevate, pigmentate o rosate, a superficie verrucosa o leucoplasica con sovrimpressione di immagini di puntato vascolare, localizzate soprattutto in zone completamente cheratinizzate, asciutte, come l'asta o la zona perianale; · - macule non rilevate, isolate o confluenti, a contorni variabili, con immagini di puntato vascolare. Mentre la papule presentano una significativa correlazione con la displasia (PIN), le macule hanno una cattiva correlazione istologica. L'importanza di una diagnosi differenziale La colorazione biancastra che si osserva in seguito all'aggiunta di ac. acetico in corso di peniscopia non è specifica per le infezioni da HPV. Diversi fattori, quali irritazioni traumatiche, candidosi e infiammazioni sostenute da altri microrganismi (HSV, Clamydia, Mycoplasmi, ecc.) possono provocare eosinofilia. La diagnosi differenziale va posta anche con gli aspetti fisiologici delle papille che talvolta circondano la corona del glande (hirsutoid papillomas) e le ghiandole sebacee ectopiche (granuli di Fordyce). Vanno inoltre diagnosticate correttamente, coinvolgendo in un rapporto interdisciplinare le altre affezioni dermatologiche quali il lichen scleroso, il lichen plano, la psoriasi, la balanite di Zoon e le forme ulcerative dell'herpes e della sifilide. Per differenziare le lesioni da HPV dagli altri cambiamenti acidofili delle lesioni della cute del pene è richiesta una notevole esperienza clinica. Le lesioni da HPV sono di solito multifocali; il disegno vascolare non è immediatamente evidente ma con l'uso del colposcopio, a maggiore ingrandimento è visibile un puntato capillare. Le lesioni preneoplastiche del pene appaiono ben marcate, spesso lievemente rilevate e con un certo grado di paracheratosi. Queste sono intensamente acidofile ed è evidente un disegno di puntato. Il disegno di mosaico appare molto tardi nei processi neoplastici ed è sospetto per il cancro invasivo. La morfologia peniscopica delle lesioni preneoplastiche del pene è molto simile a quanto viene osservato per gli epiteli cervicali, vaginali e vulvari. L'evidenza di un comune agente eziologico, quale il virus HPV 16, nelle lesioni preneoplastiche del pene, nella malattia di Bowen e nella papulosi Bowenoide sottolinea l'importanza della diagnostica molecolare con la genotipizzazione del virus HPV, sia nell'uomo che nella donna. 

Diagnostica molecolare 

Spesso nella pratica clinica si riscontrano quadri infettivi morbosi diversi dai classici casi clinici, sostenuti da coinfezioni, dovute al protrarsi di un'infezione primaria o alla difficile valutazione clinica, quando il quadro clinico viene alterato da errate terapie. La riuscita della terapia medica, molto è dovuta all'intuito e all'esperienza del Clinico. La tecnica della PCR rappresenta quanto di meglio oggi si possa pretendere dalla evoluzione delle biotecnologie nell'area della Patologia Clinica per la diagnostica delle malattie batteriche e virali. Mediante questa tecnica, si possono svelare quadri di patologie infettive latenti o con scarsa presenza di agenti infettanti, che risulterebbero di difficile diagnosi o rimarrebbero senza diagnosi con qualsiasi altra tecnica. Per contro, con la tecnica di PCR, l'elevata specificità e sensibilità, mediante cicli ripetuti amplificazione genica, si possono esaminare campioni dove la presenza del genoma (DNA o RNA) dell'agente infettante viene amplificata e quindi dall'analisi dell'acido nucleico, risalire inequivocabilmente all'agente eziologico responsabile della patologia. 

Significato clinico dell'infezione condilomatosa e l'importanza della genotipizzazione dell'HPV 

I condilomi acuminati, sessualmente trasmessi, sono causati da HPV 11/16, a basso rischio. E' stato osservato comunque che donne con condilomatosi acuminata vulvare o che hanno avuto rapporti con uomini affetti da condilomatosi acuminata sono ad aumentato rischio di sviluppare atipie epiteliali, compreso il CIN 3. L'HPV16 infatti è stato individuato in oltre il 10% dei condilomi acuminati, una importante riserva di virus implicati nella carcinogenesi cervicale. Meno visibili clinicamente sono le papule appena rilevate sulla cute, pigmentate o non pigmentate situate sul glande, prepuzio, frenulo e asta del pene. Queste lesioni sono uniche o multifocali o coalescenti, da 3/5 mm ed oltre 10mm di diametro. Esse rappresentano il caratteristico aspetto della papulosi Bowenoide, che istologicamente mostrano un range di atipia epiteliale che varia da una semplice flogosi da HPV alla displasia severa/carcinoma in situ. Le lesioni papulari occorrono in uomini giovani, sono multifocali e localizzate sia al glande che all'asta del pene e possono essere distinte dal più classico morbo di Bowen che tende ad essere unifocale, localizzato al glande del pene di uomini più anziani. Le lesioni papulari del pene sono presenti in circa il 10% degli uomini con condilomi acuminati e nel 5-10% di partners femminili con CIN3. La storia naturale di queste lesioni non è ben conosciuta, ma si presume che il potenziale maligno sia basso. L'HPV 16 è stato estratto dal 90% delle biopsie; le lesioni papulari del pene aumentano significativamente il rischio di neoplasia cervicale e rappresentano un'importante riserva di HPV ad alto rischio. Questa associazione è un altro esempio della simile epidemiologia di questa malattia che è associata con virus sia a basso che ad alto rischio, indicando che i condilomi acuminati sono la spia di altre lesioni genitali associate a flogosi da HPV. La relativa frequenza di HPV associata a papule pigmentate o no, comparata all'alta rilevanza di infezione da HPV nella donna, evidenzia in questa lesione dell'uomo, la maggiore riserva dei genotipi di HPV che sono implicati nella carcinogenesi genitale. La peniscopia, dunque in aggiunta all'esplorazione clinica, permette soprattutto la scoperta di lesioni unicamente sub-cliniche, che appaiono dopo applicazione di acido acetico sotto forma di "aree aceto-bianche" in pazienti abitualmente asintomatici, partners regolari di donne che presentano lesioni virali condilomatose. La possibilità reale che tale indagine porti ad un elevato numero di falsi positivi davanti a lesioni acidofile o papillari, dovrebbe condurre il Ginecologo e/o il Dermatologo ad affidarsi ad un esame mirato di genotipizzazione del virus dell'HPV, che orienterà verso il miglior metodo terapeutico. In considerazione dell'eziologia della neoplasia cervicale, sebbene sia ancora discusso il ruolo del maschio in questo processo, sicuro è che le infezioni sub-cliniche del pene costituiscono un importante serbatoio di HPV ad alto rischio, implicate nella carcinogenesi genitale in entrambi i sessi. Può pertanto essere definito ad alto rischio l'uomo che pone la sua partner ad un aumentato rischio di neoplasia cervicale. Simili considerazioni possono essere fatte per il maschio omosessuale che pone il suo partner a rischio di neoplasia anorettale. E' auspicabile che tale esame di Biologia Molecolare entri, in tempi brevi, nella pratica routinaria investigativa ginecologica e dermatotologica, in quanto la GENOTIPIZZAZIONE del virus HPV, proprio per l'elevata specificità e sensibilità diagnostica, può condurre con certezza alla diagnosi e alla conseguente guarigione. 

Correlazione HPV genotipo e specifiche forme cliniche forma clinica HPV genotipo 

Verruca comune   

1,2,4,41

Verruca del cavo orale   

6,16

Verruche ano-genitali   

6,11,1,2,40-45,51 (condilomi acuminati) 

Papillomi laringei   

6,11,30

Congiuntivite papillomatosa   

6,11

Neoplasia intraepit.non specificata   

33, 35

M. di Bowen   

6, 31

Papulosi Bowenoide   

16, 34,39,42 

Displasia cervicale ad alto grado   

16,18

Displasia cervicale a basso grado   

6,11,31,45

Carcinomi cervicali e vulvari   

 16,18,11,31,33,35 

 

Riepilogo informazioni sull' esame:

Gene Investigato:  

Amplificazione: regione L1 del genoma del patogeno:

Metodica Impiegata:  

 Amplificazione genica (PCR); rilevamento in gel di agarosio

Referto:  

 Report

Consenso informato:  

 Non necessario

Diagnosi Prenatale:  

 

  Tempi di risposta       4-7 gg (altri casi)
      Genotipizzazione:  8-10



Campioni biologici su cui è possibile eseguire il test:

Prelievo ematico in EDTA

 2 ml

Scraping endocervicale

 

  Tamponi vaginali

 
  Tamponi cervicali  
  Biopsie  
  Vetrini istologici in paraffina (studi retrospettivi)  
  Urine  5 ml
  Liquido seminale 1 ml

 

Conservazione: i campioni possono essere conservati a 4°C per 24 ore o a -80°C per tempi più lunghi.